Прегабалин не е GABAA или GABAB рецепторен агонист.
Прегабалин е габапентиноид и действа чрез инхибиране на определени калциеви канали. По-конкретно, той е лиганд на мястото на спомагателната α2δ субединица на определени волтаж-зависими калциеви канали (VDCCs) и по този начин действа като инхибитор на VDCCs, съдържащи α2δ субединица. Има две свързващи лекарството α2δ субединици, α2δ-1 и α2δ-2, и прегабалин показва подобен афинитет към (и следователно липса на селективност между) тези две места. Прегабалин е селективен по отношение на свързването си с α2δ VDCC субединицата. Въпреки факта, че прегабалин е аналог на GABA, той не се свързва с GABA рецепторите, не се превръща в GABA или друг GABA рецепторен агонист in vivo и не модулира директно транспорта или метаболизма на GABA. Установено е обаче, че прегабалин предизвиква дозозависимо увеличение на мозъчната експресия на L-глутаминова киселина декарбоксилаза (GAD), ензимът, отговорен за синтеза на GABA, и следователно може да има някои индиректни GABAергични ефекти чрез повишаване на нивата на GABA в мозъка. Понастоящем няма доказателства, че ефектите на прегабалин се медиират от механизъм, различен от инхибирането на α2δ-съдържащите VDCC. В съответствие с това, инхибирането на α2δ-1-съдържащите VDCC от прегабалин изглежда е отговорно за неговите антиконвулсивни, аналгетични и анксиолитични ефекти.
Ендогенните α-аминокиселини L-левцин и L-изолевцин, които много наподобяват прегабалин и другите габапентиноиди по химическа структура, са очевидни лиганди на α2δ VDCC субединицата с подобен афинитет като габапентиноидите (напр. IC50 = 71 nM за L- изолевцин) и присъстват в човешката цереброспинална течност при микромоларни концентрации (напр. 12,9 μM за L-левцин, 4,8 μM за L-изолевцин). Има теория, че те могат да бъдат ендогенните лиганди на субединицата и че могат конкурентно да антагонизират ефектите на габапентиноидите. В съответствие с това, докато габапентиноиди като прегабалин и габапентин имат наномоларен афинитет към α2δ субединицата, тяхната ефективност in vivo е в ниския микромоларен диапазон и се смята, че конкуренцията за свързване от ендогенни L-аминокиселини вероятно е отговорна за това несъответствие.

Установено е, че прегабалин притежава 6 пъти по-висок афинитет от габапентин към VDCCs, съдържащи α2δ субединица. Въпреки това, друго проучване установи, че прегабалин и габапентин имат подобен афинитет към човешката рекомбинантна α2δ-1 субединица (Ki = 32 nM и 40 nM, съответно). Във всеки случай прегабалин е 2 до 4 пъти по-мощен от габапентин като аналгетик и при животни изглежда е 3 до 10 пъти по-мощен от габапентин като антиконвулсант.